天然果胶的亲水性高，具有良好的凝胶性、增稠性和稳定性等重要的功能性，是优良的膳食纤维，可改善肠道菌相，但其抗氧化活性和低免疫调节活性相对较低，必须经酶解或酸热水解并进行分离和纯化等处理才能富集具有高免疫活性的RG I区域组分及大肠癌细胞高抑制活性的RG II区域组分。然而上述处理会使果胶分子降解，损失原来的功能特性。因此，采用无降解性方法修饰果胶的结构，以改良生物活性与疏水性相关的功能性是一重要的策略。

上海理工大学健康科学与工程学院，上海食品微生物工程技术研究中心的高 凡、丁 宁、赖凤羲*等旨在制备具有高体外抗氧化与免疫调节活性的果胶衍生物，以漆酶催化合成的百香果高酯果胶（PFP）-CA和FA衍生物为主，并阐明不同衍生处理对产物的分子构型与体外生物活性的影响。所得结果同时与抗坏血酸（VC）衍生物（没有酚氧化成醌类并键结的作用）和只添加漆酶不加酚酸的对照组作对比，以厘清酚酸组成对衍生物的分子构型与体外生物活性的影响与反应机理。本研究成果可为改性果胶在药食同源食品中的应用提供理论依据。

1、果胶提取物PFP及其衍生物的总酚含量分析

表1显示PFP的总酚含量为3.66 mg/g，只加漆酶的样品PFP-L总酚含量显著降至2.38 mg/g（P＜0.05），可能因为漆酶是多酚氧化酶，与酚酸作用后，酚酸被氧化为酚氧自由基，进而氧化形成半醌类物质，因此PFP的总酚含量显著降低。PFP-酚酸衍生物中，PFP-L-CA的总酚含量最高（12.29 mg/g）（衍生率约5.8%），其次为PFP-LFA（11.07 mg/g）（衍生率约6.2%），显著高于PFP-L-VC（4.68 mg/g）、PFP和PFP-L（P＜0.05）。故可推知有大量的FA和CA存在于PFP衍生物上。PFP-L-FA和PFP-L-CA的总酚含量略高于柑橘低酯果胶-咖啡酸交联物（CLP-CaA）的总酚含量（9.6 mg/g）。

2、果胶及其衍生物的分子质量及构象表征分析

图1为果胶及其衍生物（PFP-L、PFP-L-FA、PFP-L-CA和PFP-L-VC）在0.1 mol/L硝酸钠溶液中分子质量分布的HPSEC-MALLS色谱图。图1A显示PFP的分子分布，其中折射指数（RI）信号（信号幅度与样品浓度成正比）显示单一分子分布，出峰时间在19～28 min之间，而光散射（LS）信号（与分子粒径和浓度成正比）呈双峰（20.5 min和24 min），显示有两种分子构型密度或粒径存在。只添加漆酶的PFP-L（图1B）的果胶分子的主峰尖峰时间（24 min）与PFP相似，但大粒径尖峰（LS在20.5min处的肩峰）信号幅值减小，26 min处增加的小粒子肩峰表明PFP分子粒径或构型被部分修饰，而35 min处小尖峰为漆酶的信号峰。PFP-L-FA（图1C）和PFP-L-CA（图1D）皆呈现果胶分子LS信号的主尖峰尖锐化且尖峰时间前移到20.5 min，其中PFP-L-FA的大粒径信号（18 min）幅值减小，明显增加了小粒径肩峰（24 min）。PFP-L-VC（图1E）主尖峰尖锐化且整体出峰时间延后（即分子质量和粒径减小）且出现新的小粒径区域组分（33 min），显示果胶分子部分水解。

表2显示PFP及其衍生物的分子质量参数，PFP的平均重均分子质量（mw）为190.5 kDa，平均数均分子质量（mn）为175.1 kDa，平均多分散性指数（PDI）（PDI＝mw/mn）为1.09，固有黏度[η]平均为6.09 dL/g，MHS关系式的参数K＝0.017 mL/g、a＝0.875；而假设果胶分子在0.1 mol/L硝酸钠溶液中为球状，将上述mw和[η]值代入Flory-Fox和Einstein-Simha公式，所得平均环动半径Rg为44.5 nm、平均水合动态半径Rh为25.62 nm、非均向性构型参数ρ为1.74。与PFP比较，PFP-L的mw、mn、PDI、[η]、Rg和Rh均明显降低，构型参数a和ρ值略降低但仍接近PFP的构型参数；PFP-L-FA的mw和mn变化不明显，Rh明显降低至19.52 nm，但PFP-L-CA的mw和mn均明显增加，Rh明显升高至25.95 nm，两者的PDI、[η]、a值、Rg以及ρ值均明显降低，分别降至1.06和1.03、2.77 dL/g和4.65 dL/g、0.393和0.265、28.3 nm和34.0 nm及1.45和1.31。PLP-L-VC的mw和mn降至不到PFP的一半，伴随[η]、a值、Rg以及Rh大幅降低，分别降至0.97 dL/g、0.290、27.4 nm和10.84 nm；而PDI和ρ值明显增加，分别为1.14和2.53。整体上，MHS参数的K值随a值降低而增加。

3、傅里叶变换红外光谱分析

图2为衍生前后果胶的傅里叶变换红外光谱图，果胶PFP在3 446 cm-1处附近的宽峰为O-H的伸缩振动所引起，为糖类的特征吸收峰。在2 932 cm-1处为多糖C-H键的伸缩振动所引起；1 747 cm-1和1 641 cm-1处的伸缩振动分别对应于甲酯化和游离羧基中的C＝O键的拉伸振动信号；1 437 cm-1处是COO-的不对称伸缩振动吸收峰；1 385 cm-1和1 242 cm-1处是C-H伸缩振动吸收峰；1 110 cm-1和1 023 cm-1处的吸收峰与糖环和侧链上的C-C-O拉伸振动有关，为GalA的特征信号；1 200～800 cm-1波数之间的光谱被认为是碳水化合物的“指纹”区域。和PFP相比，PFP-L的吸收峰位置和峰面积无明显变化；然而衍生物在1 625 cm-1附近处的峰面积明显减小，1 739 cm-1附近处的峰面积明显增加，此结果表明衍生物发生了羧基酯化现象，类似CLP-FA或CLP-CaA、白萝卜果胶-FA以及羧基化可得然胶-FA衍生物的情形，其特征峰变化在1 519 cm-1或1 518 cm-1（CaA或FA）和1 616 cm-1或1 732 cm-1（分别为自由或酯化羧基）处，表明酚酸极可能通过酯键结合到果胶的羧基上。PFP-L-VC为无酚氧化成醌类并键结的参考组，图谱与PFP-L相似。

4、果胶提取物PFP及其衍生物的微观形态分析

图3显示果胶PFP及其衍生物的干燥粉粒的微观形态。PFP在放大100 倍下（图3A1）呈现不规则形状的碎片与颗粒，在放大1 000 倍下（图3A2）清楚可见这些碎片黏附紧密。PFP-L在放大100 倍下（图3B1）表面呈现出松散的不规则絮状碎片，在放大1 000 倍下（图3B2）碎片显得松散且部分卷曲。PFP-L-FA在放大100 倍下（图3C1）呈光滑的大片折叠、松散并稍微卷曲，放大1 000 倍下（图3C2）片状非常光滑。PFP-L-CA（图3D1）和PFP-L-VC（图3E1）在放大100 倍下都呈现不规则长条的絮状片，介于PFP-L和PFP-L-FA的中间混合形态。以放大1 000 倍观之，PFP-L-CA（图3D2）的絮状片呈不规则的断层状，而PFP-L-VC（图3E2）絮片呈大片折叠且平整光滑。显然，百香果皮果胶经过添加漆酶和酚酸衍生和VC作用后，粉粒的微观结构会明显改变，呈松散且大片絮状化。此现象与CLP-CaA干燥膜的结构呈絮状片且比CLP松散的现象一致。

5、果胶提取物PFP及其衍生物的体外抗氧化活性分析

图4显示PFP及其酚酸衍生物对DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子自由基清除率以及Fe2+螯合率和总还原力均呈明显的剂量-效应关系。图4A说明质量浓度0.1～2.0 mg/mL的PFP对DPPH自由基的清除率达到18%～27%，与PFP-L接近。质量浓度1.5～2.0 mg/mL的PFP-L-CA DPPH自由基清除率高达65%～70%，约达到VC的70%（阳性对照）。然而，与PFP相比，PFP-L-FA和PFP-L-VC在所研究的质量浓度范围内DPPH自由基清除率明显较低。对于超氧阴离子自由基的清除率（图4B），PFP-L-CA和PFP-L-FA的清除率随着质量浓度（1～2 mg/mL）增加而升高，与PFP相比明显升高，在质量浓度2.0 mg/mL时均达到100%，与VC的清除率接近。质量浓度0.1～2.0 mg/mL PFP的超氧阴离子自由基清除率（40%～50%）在所有样品中处于中等水平，且PFP-L和PFP-L-VC的超氧阴离子自由基清除率随着质量浓度的提高平稳增加，在质量浓度2.0 mg/mL时达到约50%，与PFP相同。超氧阴离子自由基清除率对所有样品都表现出明确的浓度依赖性。对于羟自由基的清除能力（图4C），所有改性果胶，尤其是PFP-L-FA，在质量浓度0.1～2.0 mg/mL时清除率为40%～78%，明显高于PFP（15%～40%），且呈样品浓度依赖性。与PFP相比，所有改性果胶都显示出Fe2+螯合能力（图4D）和还原能力（图4E）增强。

6、胶提取物PFP及其衍生物的体外免疫活性分析

图5A显示，质量浓度0.2～1.0 mg/mL PFP及其衍生物处理后，RAW264.7细胞存活率大都维持在85%～110%，样品组间的差异不显著（P＞0.05），与0.001 mg/mL LPS处理组相比，除0.8～1.0 mg/mL PFP-L-CA处理组细胞存活率显著降低外，其他组比无显著变化（P＞0.05）。说明在所探讨的质量浓度范围内PFP果胶及其酚酸衍生物（0.8～1.0 mg/mL PFP-L-CA除外）对RAW264.7细胞无显著抑制作用（P＞0.05）。在RAW264.7细胞对中性红的吞噬能力方面（图5B），所有样品刺激的细胞吞噬能力都有浓度依赖性。与LPS处理组相比，质量浓度0.2～1.0 mg/mL PFP及0.2 mg/mL PFP-L处理会高度显著降低细胞吞噬能力（P＜0.001）；而0.6～0.8 mg/mL PFP-L、0.4～1.0 mg/mL PFP-L-FA、0.4～1.0 mg/mL PFP-L-CA和0.8～1.0 mg/mL PFP-L-VC处理会显著促进细胞吞噬能力（P＜0.05、P＜0.001），酚酸（FA和CA）衍生组细胞吞噬能力最高达118%。在刺激RAW264.7细胞分泌NO方面（图5C），大部分样品刺激NO分泌量都有浓度依赖性。和空白组相比，0.2～1.0 mg/mL PFP处理组的NO生成量差异不显著（P＞0.05）；0.2～0.6 mg/mL PFP-L、0.4～0.6 mg/mL PFP-L-FA、0.4～0.8 mg/mL PFP-L-CA和0.2～0.8 mg/mL PFP-L-VC处理组的NO生成量显著增加（P＜0.05、P＜0.01、P＜0.001），且PFP-L、PFP-L-FA和PFP-L-CA的刺激效果相似，在0.6～0.8 mg/mL质量浓度下刺激的NO生成量达最大（36～42 μmol/L），相当于0.001 mg/mL LPS组的72%～85%。说明过高剂量（质量浓度0.8～1.0 mg/mL）反而降低NO生成量，抑制免疫活性。

结 论

本研究主要分析了PFP及其CA与FA衍生物的分子特性和红外光谱差异，并研究了酚酸结构对PFP衍生物抗氧化活性和免疫活性的贡献差异关系。结果表明酚酸衍生可使PFP-L-FA和PFP-L-CA的总酚含量分别显著提高至11.07 mg/g和12.29 mg/g；分子性质方面，PFP-L-CA的m w 提升至256.5 kDa，而PLP-L-FA的m w 无明显变化（187.8 kDa），且两者的分子构象均由PFP的刚性短杆状变为链段较柔软的无规则线圈状；红外光谱显示衍生物分别在1 625 cm -1 和1 739 cm -1 的峰面积减少和增加均证明了酚酸通过酯键与PFP共价接枝，且衍生物粉粒的微观结构趋于松散和絮状化。此外，CA与FA衍生物的体外抗氧化活性（羟自由基、超氧阴离子自由基清除率和总还原力）和细胞免疫活性显著增强，体现在小鼠巨噬细胞NO生成量的增加和中性红吞噬能力的提升。综上，本研究所制备PFP酚酸（CA与FA）衍生物具有活性膳食纤维和保健食品的应用前景，研究为改性果胶的商业化应用提供理论参考，未来研究可详细解析衍生果胶与生物活性（如免疫和抗癌）的构效关系、机理、流变特性与加工稳定性。

本文《百香果高酯果胶-酚酸衍生物的分子特征、体外抗氧化和免疫活性》来源于《食品科学》2022年43卷17期84-94页，作者：高凡，丁宁，艾连中，赖凤羲，张汇，宋子波。DOI:10.7506/spkx1002-6630-20210706-052。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

修改/编辑：袁艺；责任编辑：张睿梅

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为进一步促进动物源食品科学的发展，带动产业的技术创新，更好的保障人类身体健康和提高生活品质，北京食品科学研究院和中国食品杂志社在宁波和西宁成功召开前两届“动物源食品科学与人类健康国际研讨会”的基础上，将与郑州轻工业大学、河南农业大学、河南工业大学、河南科技学院、许昌学院于 2022年12月3-4日 在河南郑州共同举办“2022年动物源食品科学与人类健康国际研讨会”。欢迎相关专家、学者、企业家参加此次国际研讨会。