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真菌的DNA和RNA提取要领


http://www.plant-extract.com.cn2015-10-13 13:28:45

 

  一、真菌DNA的提取(要领一)

  1.尝试试剂

  (1)DNA提取液:0.2M Tris-HCl(pH 7.5),0.5M NaCl,0.01M EDTA,1%SDS

  (2)3M NaAc

  (3)TE:10 mmol/L Tris-HCl pH8.0,1 mmol/L EDTA

  (4)酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)

  (5)氯仿:异戊醇(24:1)

  (6)异丙醇

  (7)无水乙醇

  (8)75%乙醇

  (9)RNaseA

  2.尝试步调

  (1)取真菌菌丝0.5g,在液氮中敏捷研磨成粉

  (2)插手4mL提取液,快速振荡混匀

  (3)插手等体积的4mL的氯仿:异戊醇(24:1),涡旋3~5min(此处是粗提没有加酚,可以节省本钱)

  (4)1000rpm,4℃,5min

  (5)上清用氯仿:异戊醇(24:1)再抽提一次(10,000rpm,4℃离心5min)

  (6)取上清,插手2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇或2.5倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约30 min

  (7)用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇重复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中

  (8)插手1ul RNaseA (10mg/mL),37℃处理赏罚1h

  (9)用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)

  (10)取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上

  (11)沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃生涯备用

  二、真菌DNA的提取(要领二)

  1.真菌菌丝0.5-1g,在液氮中敏捷研磨成粉

  2.插手3mL 65℃预热的DNA提取缓冲液,快速振荡混匀65℃水浴30min,时代混匀2-3次

  3.插手1mL 5M KAc,冰浴20min

  4.氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)

  5.取上清,插手2/3倍体积的-20℃预冷异丙醇,混匀,静置约30 min

  6.用毛细玻棒挑出絮状沉淀,用75%乙醇重复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗1次,吹干,重悬于500ul TE中

  7.插手1ul RNaseA(10mg/mL),37℃处理赏罚1h

  8.用酚(pH8.0):氯仿:异戊醇(25:24:1)和氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次(10,000rpm,4℃离心5min)

  9.取上清,1/10V 3M NaAc,2.5V体积的无水乙醇,-70℃沉淀30min以上

  10.沉淀用75%乙醇漂洗,风干,溶于200ul TE中,-20℃生涯备用

  DNA提取缓冲液:100mM Tris-HCl(pH8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.5M NaCl,2% CTAB(W/V),4% PVP40(W/V)和2%巯基乙醇(V/V),PVP和巯基乙醇行使前插手5M KAc

  要领一和二,是大同小异.首要是DNA提取液配方纷歧样!本钱也纷歧样!

  三、真菌菌丝的总RNA的提取

  1.尝试试剂

  (1)RNA提取缓冲液(CTAB):2% CTAB(W/V),2%聚乙烯吡咯烷酮PVP(W/V),100mM Tris-HCl(pH8.0,DEPC处理赏罚的水设置),25mM EDTA,0.5g/L亚精胺Spermidine,2.0M NaCl,2%巯基乙醇(V/V,行使前插手).因为在高温灭菌前提下,Tris-HCl要和DEPC产生回响,以是配RNA提取缓冲液时直接用DEPC处理赏罚的水配制即可

  (2)SSTE:1 M NaCl,0.5% SDS(W/V),10mM Tris-HCl pH8.0,1.0mM EDTA

  (3)10M LiCl直接用蒸馏水配10M LiCl,加1‰的DEPC留宿后,高温灭菌

  (4)3M NaAc

  (5)氯仿:异戊醇(24:1)

  (6)酚(pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)

  (7)DEPC处理赏罚水用1‰的DEPC处理赏罚蒸馏水留宿,高温灭菌

  (8)无水乙醇;70%酒精

  2.尝试步调

  (1)尝试开始前将RNA提取液于65℃水浴锅中预热,离心管中插手ME(巯基乙醇),(10mL加80ul,50mL中插手300ul)

  (2)取约0.8g菌丝体(液体作育得到的菌丝用真空抽滤即可!固体作育就更好说了),在液氮中敏捷磨成风雅粉末,装入50mL离心管,按1g原料8mL的量插手预热的RNA提取液,颠倒混匀

  (3)65℃水浴3-10 min,时代混匀2-3次

  (4)插手等体积的酚(留意是酸酚pH4.5):氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

  (5)取上清,等体积的氯仿:异戊醇(24:1)抽提(10,000rpm,4℃,5 min)

  (6)插手1/4V体积10M LiCl溶液,4℃安排6h以上(或留宿)

  (7)10,000rpm,4℃离心20min

  (8)弃上清,用500ul SSTE消融沉淀

  (9)酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提两次,氯仿:异戊醇(24:1)抽提1次(10,000rpm,4℃,5min)

  (10)加2V体积的无水乙醇,在-70℃冰箱沉淀30min以上

  (11)12,000rpm,4℃离心20 min

  (12)弃上清.沉淀用70%酒精漂洗一次,干燥

  (13)加200ul的DEPC处理赏罚水消融

  (14)用非变性琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计扫描检测RNA的质量

  (在抽提进程中,若卵白质含量或其余的杂质还较多,可以增进抽提次数)

  留意:提取RNA请只管在低温下操纵,假如前提不允许,在室温下操纵的时刻要尽也许的短.