生意宝
植提网 > 植提检测 > 菌类提取物检测 > 黄伞菌提取工艺和免疫活性研究

黄伞菌提取工艺和免疫活性研究


http://www.plant-extract.com.cn2015-10-13 13:25:15

 

  黄伞学名Pholiota.adiposa,又名柳蘑,黄蘑,多脂鳞伞,在分类学上属真菌门Eumycota,担子菌亚门Basidiomycotina,层菌纲Hymenomycetes,伞菌目Agaricales,球盖菇科Strophariaceae,环锈伞属GenusPholipta。秋季生于杨、柳、桦等的倒木或枯枝上,偶然也生于针叶树干上,单生或丛生。在我国河北、山西、吉林、浙江、河南、西藏、广西、甘肃、青海、陕西、新疆、四川、云南等地林区均有漫衍[1]。黄伞菌是一种食药两用菌,其药用代价尤其突出。据报道其子实体外貌的一层粘质经盐水、温水、碱溶剂提取的多糖有很好的抑菌抗癌浸染,其对小白鼠肉瘤S-180和艾氏腹水癌的克制率达80%~90%[1],还能提防葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎杆菌和结核杆菌传染[2]。通过单身分和正交试验优化等要领,研究黄伞菌丝体多糖水提醇沉工艺,并研究了菌丝体多糖的免疫调理活性,以期促进黄伞菌丝体多糖的开拓和操作。

  1原料与要领

  1.1原料

  1.1.1黄伞菌株河北省茂盛县山区采摘,野陌生散作育;小鼠:Balb/c小鼠(SPF级,8~10周龄,体重28±2g),中国科学院尝试动物研究中心。

  1.1.2首要试剂RPMI1640作育基,0.25%胰卵白酶,胎牛血清(FBS)购自GIBCO公司;青霉素和链霉素购自AMRESCO公司;AlamarBlueAssayKitBiosource公司;植物凝集素(PHA)为Sigma公司产物,其余常用化学试剂,行业标准,均为国产说明纯。RPMI1640完全作育基:RPMI1640作育基中加10%加热灭活的胎牛血清,青霉素30μg/mL,链霉素100μg/mL。

  1.1.3作育基

  1.1.3.1母种作育基改善综合PDA作育基:马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂粉15g、麦芽提取物2g、水1000mL、MgSO40.2g、KH2PO40.25g、K2HPO40.25g、VB10.5mg,pH天然。

  1.1.3.2液体作育基作育基配方:葡萄糖20g、酵母浸粉8g、KH2PO40.4g、K2HPO40.4g、VB120mL(10μg/mL)、pH天然。

  1.1.4仪器二氧化碳作育箱:Thermo公司;SynergyHT酶标仪:BIO-TEK公司;细胞计数仪:BECKMAN-COULTER公司;Centrifuge5415D、5810R离心机:Eppendorf公司;超静事变台,恒温作育箱,干燥箱,恒温水域锅,摇床,高压锅为尝试室通例仪器。

  1.2要领

  1.2.1母种作育取收藏菌种,无菌操纵接种于母种作育基上,25℃下作育10d,菌丝体长满斜面。

  1.2.2摇瓶作育无菌接种后,摇瓶于25℃前提下静置48h,尔后置于25℃、125r/min作育12d。作育完毕后,发酵液用八层纱布过滤,菌丝体60℃烘干至恒重,备用。

  1.2.3粗多糖提取称取菌丝体干粉10g,放入回流瓶中,加蒸馏水,热水提取,4500r/min离心10min取上清去沉淀,沉淀同法一再提取一次,归并两次上清液并于80℃水浴浓缩后,边搅拌边插手乙醇,醇析后4500r/min离心10min弃上清液,得沉淀物,依次用无水乙醇(1次)、丙酮(2次)洗涤沉淀,60℃干燥得菌丝体粗多糖。

  1.2.4多糖测定苯酚硫酸法[3]。

  1.2.5单身分计划

  1.2.6淋巴细胞免疫试验

  1.2.6.1小鼠脾淋巴细胞(体外)的制备[4-5]颈椎脱臼正法小鼠,无菌前提下取脾,置于100目灭菌不锈钢筛网上,用打针器内塞将脾研碎,过筛,用PBS冲洗网筛2~3遍,脾细胞的悬液转入无菌的离心管中,再插手PBS至30~40mL,400g离心6min,网络细胞,在室温下加NH4Cl溶液(1.5mL/只),不绝枪打或摇摆混匀细胞10min,以裂解红细胞,加PBS至30~40mL,400g离心5min,去除上清液,插手少量RPMI1640作育基细胞计数仪计数后,用RPMI1640稀释细胞悬液至2×106个/mL待用。

  1.2.6.2细胞增殖率的测定[4]180μL特定浓度的细胞悬浮液加至96孔板中,别离插手20μL的差异的样品和阳性比较植物血凝素,阴性比较插手20μLPBS。在37℃和5%CO2的前提下作育3d后,用ELISA自动读板仪别离测定570nm和600nm的吸光度,插手20μLAlamarBlue显色剂,作育6~8h,再次测定570nm和600nm的吸光度,然后按照AlamerBlueAssay给的公式计较百般品对淋巴细胞的激活率。淋巴细胞增殖率[117216×Aλ570(sample)-80586×Aλ600(sample)]/[117216×Aλ570(control)-80586×Aλ600(control)]×100%(1)

  2试验功效

  2.1毁坏粒径对多糖提取的影响由图1可知,毁坏粒径对粗多糖和多糖提取具有必然影响,当粒径小于120目时颗粒直径对粗多糖和多糖提取量影响不大,大于120目时粗多糖提取量随粒径减小而增进,以颗粒160目时粗多糖提取量和多糖提取量最大,以是最佳毁坏粒径为160目。

  2.2提取时刻对多糖提取的影响图2表白提取时刻对粗多糖和多糖提取量影响不大。个中以3和7h粗多糖提取量和多糖含量较高,多糖含量别离为59.3%和63.1%。思量到增进提取时刻就会增进能耗,而多糖提取量增进又很少,以是选择提取时刻为3h。

  2.3加水体积对多糖提取的影响图3表现加水量对粗多糖和多糖提取量的影响不大,固然加水量为1:50时粗多糖提取量最高,但多糖含量只有47.86%远低于1:20加水量时的51.19%和1:40时的54.1%,导致多糖提取量增进很少,即1:50加水时有利于其他物质被提出而对多糖的提取影响不大,因为加水越多后续浓缩就越坚苦,且能源耗损大,本钱进步,以是选择加水量为1:20。

  2.4提取次数对多糖提取的影响功效见表3,提取次数同粗多糖提取率成正比,同多糖含量成反比。固然提取3次时粗多糖提取率高达10.19%,但因为多糖含量降落,检测技术,致使最终多糖提取量增进很少,而增进的只是杂质。以是颠末1次提取即可到达有用提取多糖的结果。

  2.5提取温度对多糖提取的影响图4表现,温度与多糖提取相关亲近,80℃是较相宜的提取温度。此时,多糖提取量最高,且多糖含量也较高,表白粗多糖中杂质较少,有利于纯化。

  2.6醇析时刻对多糖提取的影响图5表现醇析12h提取液中多糖已根基所有析出,再增进醇析时刻多糖量增进不明明。

  2.7醇析浓度对多糖提取的影响由图6可见最相宜乙醇体积分数为100%,即无水乙醇。但粗多糖提取量随乙醇体积分数升高而增进的幅度要大于多糖提取量,即粗多糖中溶入的杂质量增进,倒霉于纯化。

  2.8醇析体积对多糖提取的影响图7表白插手乙醇体积在3倍以上时,多糖提取量增进不明明,但粗多糖明明增进,可见乙醇体积高出3倍时继承增进乙醇用量只会增进杂质而对多糖没有影响。以是乙醇用量1:3时较相宜。

  2.9正交试验优化提取工艺在上述单身分试验功效基本上,选取提取时刻(A)、加水体积(B)、提取温度(C)、乙醇插手体积(D)举办正交试验,进一步优化提取工艺,功效见表4。按照极差说明得出影响身分主次次序:C、D、A、B。即在提取中要出格留意节制好提取温度,其次醇析时乙醇插手量,再次是提取时刻,最后是加水量。最佳提取工艺是A1B3C2D3,即提取时刻2.5h,加水体积1:25、提取温度80℃,醇析多糖时行使无水乙醇、3.5倍于多糖溶液、醇析12h。由表5可见,提取温度对多糖提取的影响较明显(p<0.10),提取时刻、加水体积和乙醇体积的影响不明显(p>0.10),即提取温度对黄伞菌丝体多糖提取的影响起首要浸染。在多糖提取工艺中加水体积和提取时刻直接影响到出产本钱和事变量,团结正交试验极差和方差说明功效,本试验选择最优组合为A1B1C2D3,即提取时刻2.5h、料水比1:15、提取温度80℃和乙醇体积1:3.5。

  2.10免疫调理试验功效图8表现,黄伞菌丝体粗多糖示意出精采的刺激小鼠脾淋巴细胞增殖浸染,在低浓度50μg/mL时小鼠脾淋巴细胞增殖率为141%,跟着多糖浓度的升高,小鼠淋巴细胞增殖率逐渐升高,当浓度为500μg/mL时增值率到达最高的230%,略低于阳性比较PHA(274%),表白黄伞菌丝体粗多糖具有体外调理免疫的浸染,且示意为剂量依靠。

  3结论

  通过单身分试验和正交试验确定了黄伞菌丝体多糖提取最佳工艺,即菌丝体毁坏粒径为80目、加水量1:15、提取时刻2.5h、提取温度80℃、提取1次,醇析多糖时行使无水乙醇、3.5倍于多糖溶液、醇析12h。免疫活性研究表现黄伞菌丝体粗多糖,可以刺激小鼠脾淋巴细胞增殖,表白黄伞菌丝体粗多糖具有调理免疫的浸染,且示意为剂量依靠。连年来有关多糖的研究报道增进迅猛,正逐渐成为成果性食物和新药筛选的新来历。多糖作为药物始于1943年,作为广谱的免疫促进剂而引起人们的极大乐趣是在20世纪60年月往后[7],大量研究表白,多糖具有明明的加强机体免疫手段[8-11]和克制肿瘤[12]的浸染。黄伞菌作为食药两用菌,具有抗肿瘤浸染[13-14],同时对免疫体系也具有调理浸染,苏延友等[15](2004)报道黄伞子实体多糖可以激活小鼠腹腔巨噬细胞;李德海等[16]研究发明(2010)黄伞子实体多糖能明显进步小鼠的免疫器官质量;本研究表现黄伞菌丝体多糖同子实体多糖一样对免疫体系具有调理浸染。大型真菌的菌丝体出产不受季候、情形身分影响,可以实现整年出产,大大改进了子实体出产的破绽,同时大型真菌子实体今朝市场代价较高,如再进一步深加工势必导致深加工产物价值奋发,难于推广,而菌丝体出产本钱低,作为深加工质料上风明明,检测技术,信托黄伞菌丝体多糖具有精采的开拓和应用远景。